1仪器设备及操作
本技术采用的显微镜为OLYMPUS DP70，由日本生产(图1)，图像的分辨率可高达4080×3072像素。利用油镜镜头，最大放大倍数可达1000倍。

图1 本研究使用的OLYMPUS DP70显微镜 Figure 1 The Olympus Digital Microscope DP70 Model used in this study

 
显微镜（油镜）观察的操作步骤：

(1) 样品对焦：先用低倍物镜对样品对焦。

(2)  香柏油覆盖样品：油镜下在盖玻片上滴一滴香柏油。

(3)  聚焦观察：调节细准焦螺旋。

(4)  观察记录：眼睛观察，找到合适视野，记录、照相;观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，取下载玻片。

(5) 镜头清洁：先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用少许无水乙醇擦去镜头上残留油迹，最后最后擦干清洗剂。

2化学试剂及配制
吸取10 mL A溶液(A: 碱性复红[又称碱性品红， fuchsin] 1 g; 无水乙醇 10 mL (10%w/v))与90 mL B液(B: 石炭酸(苯酚)5 g, 溶于mili-Q超纯水 100 mL (5%w/v))，充分混合成石炭酸复红液，4℃保存。使用前稀释10倍，再用Pall Supor® Membrane 0.45 μm滤器过滤除菌，待用。

3实验流程
3.1制备观察菌液
将新鲜活化的Bt 菌株在NB培养平板上30℃倒置培养 72 h以上，至芽孢完全形成。

3.2制片
(1) 取一滴ddH₂O点在载玻片中央，挑取少量菌苔在水滴中反复涂布均匀。

(2) 当水滴充分风干，可 火加热使水分加快蒸发。

(3) 将已干燥的涂片在微火上迅速通过2-3次，使菌体与玻片结合牢固。

(4) 待切片冷却即可进入染色步骤。

3.3染色
(1) 滴加石炭酸复红染液于涂片上，室温染色30~60S。

(2) 然后倾去染液，用水清洗至无色。

(3) 盖上盖玻片，准备观察。

3.4观察

(1) 将切片置于显微镜100X油镜下进行观察：调节粗调旋钮，让油镜浸没在松柏油中，尽量靠近观察玻片，但不要让镜头接触到玻片。然后轻微调节旋钮使物镜缓慢上升至图像出现，然后调节微调旋钮至图像清晰可见。

(2) 镜检时，晶体蛋白呈红色，芽孢呈无色。

3.5拍照
设置显微镜照相系统的各种拍照参数，调节好背景颜色。注意每张照片上要有标尺，一般取10 μm。

4例证分析
Bt 的最主要特征就是在生长后期产生芽孢和伴孢晶体，因此可以在这个时期用显微镜来观察。本案例中，我们以Bt分离株S2160-1 (Zhang et al., 2012)、模式菌株HD-73为实验材料，采用石炭酸复红染液色的方法对生长后期的Bt菌进行染色镜鉴。如图2观察结果显示，在以红色或浅红色为背景下，2个菌株都能观察到无色的芽孢； HD-73都为红色的菱形晶体，S2160为红色圆形晶体。

图2 光学显微镜观察Bt菌株(100×油镜) Figure 2 Bt strains observed by optical microscopy with 100× oil immersion len

 
5讨论
要获得高质量的显微镜观察照片，实验过程中需要注意以下几点：

首先，待观察的菌体要培养到芽孢完全形成，即48-72 h以上不同的菌株可能不同，保证存在预期需要观看的内容的材料。

其次，切片上的菌苔涂布要均匀，切勿挑取过多的菌体进行涂布，否则会导致菌体不够分散，重叠在一起，不能清楚观察到晶体和芽孢的形状；切勿挑取到培养基，否则会影响观察的背景。

第三，待观察的切片要保留适当的水分，太干燥了，也不利于观察，因此，最好的观察时间是制作完成后立即观察。

最后，显微镜的选择与调节也很重要，如果显微镜成像系统不好，即使观察结果很好，但不能获得高质量的照片，也不能将结果呈现给我们。

发表论文
Zhang W., Crickmore N., George Z., Xie L., He Y.Q., Li Y., Tang J.L., Tian L., Wang X., and Fang X., 2012, Characterization of a new highly mosquitocidal isolate of Bacillusthuringiensis--an alternative to Bti? J. Invertebr. Pathol., 109(2): 217-222